Вы находитесь в разделе: Главная \ НАШИ ИССЛЕДОВАНИЯ \ Влияние на иммунитет человека \ Влияние на лимфоидные клетки крови
Введение. В проведенном нами ранее исследовании было показано, что Криомелт способен улучшать клеточную жизнеспособность в культуре мононуклеарных клеток крови человека, возможно за счет мембраностабилизирующего эффекта и сдерживания процессов, приводящих к клеточному некрозу.
Цель настоящей работы - охарактеризовать иммуномодулирующие свойства Криомелт в ранее выбранном диапазоне концентраций.
Материалы и методы. В исследовании были использованы мононуклеарные клетки (МНК) крови 10 здоровых доноров (5 мужчин и 5 женщин в возрасте 25-42 г), выделенные из крови градиентным центрифугированием. Клетки в концентрации 2 x 106/мл культивировали в течение 36 ч в присутствии неспецифического митогена- ФГА (фитогеммаглютинин Р, PHA P, Sigma) и различных концентраций криомелта (0.5х10-7 г/л, 1.0 х 10-7г/л, или 2.0 х 10-7г/л). В контрольных пробах клетки культивировали либо в среде (без ФГА и КР), либо присутствии только ФГА или КР. По окончании культивирования определяли следующие параметры:
Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного критерия Стьюдента.
Результаты. Известно, что соотношение разных субпопуляций Т-лимфоцитов, вовлеченных в иммунный ответ, определяет силу и направленность иммунных реакций. Согласно данным представленным в таблице 1, КР не оказывал значимого влияния на содержание CD4+ Т-клеток в митогенактивированной лимфоидной популяции.
Таблица 1. Процентное содержание CD4+ Т-лимфоцитов.
№ донора |
Контроль-среда |
ФГА |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
КР (2.0 х 10-7 г/л) |
1 |
40,8 |
27,4 |
27,4 |
30,6 |
28,1 |
31,2 |
2 |
29,7 |
30,4 |
30,4 |
30,1 |
31,4 |
32,6 |
3 |
46,2 |
40,8 |
40,8 |
43,5 |
42,2 |
39,9 |
4 |
32,4 |
31,9 |
31,9 |
30,7 |
35,6 |
34,7 |
5 |
37,6 |
36,5 |
36,5 |
37,6 |
32,8 |
33,8 |
6 |
25,2 |
23,6 |
23,6 |
21,7 |
22,1 |
23,1 |
7 |
38,9 |
43,5 |
43,5 |
42,1 |
39,9 |
39,2 |
8 |
40,6 |
36 |
36 |
24,5 |
39,8 |
41,2 |
9 |
49,1 |
51 |
51 |
50,5 |
46,7 |
52,3 |
10 |
19,9 |
29,4 |
29,4 |
29,4 |
27,9 |
28,8 |
M + |
36,04 |
35,05 |
34,07 |
35,75 |
Криомелт также не оказывал существенного влияния на содержание в митоген-активированной клеточной популяции хелперных CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитов, ответственных за долговременную иммунную память (таблица 2)
Таблица 2. Процентное содержание CD4+СD45RO+ Т-лимфоцитов.
№ |
Контроль-среда |
ФГА |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
КР (2.0 х 10-7 г/л) |
1 |
21,1 |
13,2 |
15,6 |
13,2 |
15,4 |
21,4 |
2 |
17,6 |
17,5 |
17,3 |
18,6 |
19,5 |
25,3 |
3 |
27,4 |
24 |
25,9 |
25 |
23,6 |
24,3 |
4 |
15,4 |
15,1 |
14,8 |
17 |
16,6 |
17,9 |
5 |
19,4 |
19,3 |
20,9 |
16,8 |
17,6 |
19,3 |
6 |
17 |
15,3 |
14 |
14,7 |
15,3 |
18,8 |
7 |
22,6 |
24 |
22,6 |
21,5 |
21,5 |
29,8 |
8 |
19,7 |
14,4 |
9,6 |
17,1 |
16,8 |
20,8 |
9 |
24,8 |
23,3 |
22,8 |
22,5 |
24 |
н.т. |
10 |
10,2 |
14,9 |
14,9 |
14,6 |
14,5 |
н.т. |
M + |
Примечание: н.т.- не тестировано.
Данные процентного содержания СD4+ Т-хелперных лимфоцитов в митоген-активированных клетках суммированы на рисунке 1
Рисунок 1. Процентное содержание CD4+/RO+ и CD4+/RO- Т-лимфоцитов.
Таким образом, на основе полученных данных можно предположить, что действие Криомелт на иммунитет не связано с увеличением процентного содержания в популяции лимфоцитов хелперных CD4+ Т-лимфоцитов.
Твердо установлено, что развитие противовирусных эффекторных иммунных реакций ассоциируется с генерацией СD8+ Т-лимфоцитов Данные, характеризующие влияние Криомелт на содержание CD8+ и СD8+RO+ Т-лимфоцитов, представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3. Процентное содержание CD8+ Т-лимфоцитов.
№ |
Контроль-среда |
ФГА |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
КР (2.0 х 10-7 г/л) |
1 |
2,7 |
10 |
8,4 |
14 |
9,3 |
19,4 |
2 |
3,8 |
19,9 |
15,9 |
16,6 |
20,7 |
29,9 |
3 |
4,5 |
14,8 |
15,8 |
15,8 |
13,7 |
22,1 |
4 |
6,8 |
15,6 |
16,3 |
14,1 |
13,4 |
26,3 |
5 |
11,7 |
20,5 |
13,9 |
15,3 |
15,1 |
20,9 |
6 |
31,7 |
40 |
41,2 |
40,9 |
42,5 |
46,1 |
7 |
2,8 |
11,5 |
8,6 |
6,2 |
7,2 |
19,2 |
8 |
3,4 |
9,6 |
10,8 |
17 |
15,1 |
18 |
9 |
3,9 |
12,6 |
11,2 |
12,6 |
12,4 |
н.т. |
10 |
2,8 |
6,6 |
5,9 |
4,9 |
6,5 |
н.т. |
M + |
Таблица 4. Процентное содержание CD8+CD45RO+ Т- лимфоцитов.
№ доно ра |
Контроль-среда |
ФГА |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
ФГА+КР |
КР (2.0 х 10-7 г/л) |
1 |
0,5 |
1,7 |
1,2 |
2,5 |
1,7 |
4,1 |
2 |
0,3 |
3,2 |
2,6 |
2,6 |
3,8 |
6,7 |
3 |
0,8 |
4,6 |
4,8 |
4,7 |
3,9 |
6,8 |
4 |
0,9 |
2,3 |
1,9 |
1,6 |
1,6 |
3,9 |
5 |
1 |
2,2 |
1,2 |
1,2 |
1,2 |
1,9 |
6 |
1 |
2,1 |
1,9 |
2 |
2,4 |
3,2 |
7 |
0,4 |
1,8 |
1,3 |
1 |
1,1 |
3,8 |
8 |
0,2 |
0,5 |
0,7 |
1,7 |
1,3 |
1,7 |
9 |
0,9 |
3,4 |
2,9 |
4 |
3,9 |
н.т. |
10 |
1,1 |
0,9 |
1 |
0,7 |
1,1 |
н.т. |
M + |
Данные таблиц 3 и 4 суммированы на рисунке 2.
Рисунок 2. Процентное содержание CD8+/RO+ и CD8+/RO- Т-лимфоцитов.
Таким образом, согласно полученным данным, Криомелт не оказывал существенного влияния на процентное содержание CD8+/RO+ и CD8+/RO- Т-лимфоцитов в митоген-активированной клеточной популяции. С другой стороны, выявлено самостоятельное влияние Криомелт (в отсутствие митогена) на содержание цитотоксических Т-лимфоцитов в лимфоидной популяции. Как следует из представленных данных, в присутствии Криомелт имело место более чем двукратное достоверное увеличение содержания СD8+ Т-клеток и четырехкратное увеличение CD8+CD45RO+ Т-клеток (P < 0.05).
Цитофлюорограммы, характеризующие влияние Криомелт на субпопуляционный состав CD8+ Т-лимфоцитов, приведены ниже.
№ 1.
№2
№3
№4
№5
№6
№7
№8
№9
№10
Как известно, воспалительная реакция является неотьемлемой частью иммуногенеза. Избыточность или недостаточность воспаления играют значимую роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе и тех, которые обусловлены вирусной инфекцией. ФНО-альфа и ИЛ-6 –цитокины, в значительной степени определяющие степень воспаления. Данные, характеризующие влияние Криомелт на продукцию этих цитокинов представлены в таблицах 5 и 6 и рисунках 3 и 4.
Таблица 5. Содержание ФНО-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах.
№ |
ФГА |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
КР |
1 |
16 |
14,5 |
12 |
16,5 |
11,5 |
2 |
92 |
77 |
96,5 |
91 |
12,5 |
3 |
19 |
12,5 |
15 |
13 |
19,5 |
4 |
156 |
121 |
23,5 |
26 |
60,5 |
5 |
53,5 |
40,5 |
52 |
76 |
47,5 |
6 |
8 |
6 |
0 |
6,5 |
5,5 |
7 |
50 |
17 |
17 |
19 |
33 |
8 |
38 |
16 |
18 |
16 |
25 |
9 |
9 |
32 |
12 |
17 |
н.т |
10 |
16 |
12 |
14 |
10 |
н.т |
M + |
45,75 |
34,85 |
26,17 |
29,1 |
26,8 |
Рисунок 3. Концентрация ФНО-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах.
Согласно полученным данным КР, обладал достоверной способностью (P < 0.05) супрессировать продукцию ФНО-альфа, осуществляемую митоген-активированными мононуклеарными клетками.
Таблица 6. Содержание ИЛ-6 (пг/мл) в культуральных супернатантах.
№ |
ФГА |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
КР |
1 |
637 |
730 |
688 |
770,5 |
273,5 |
2 |
810 |
827,5 |
810 |
874 |
459 |
3 |
804 |
806 |
812 |
774 |
784 |
4 |
766,5 |
887 |
821,5 |
805,5 |
769 |
5 |
847,5 |
857,5 |
870 |
793,5 |
913,5 |
6 |
152 |
187 |
102,5 |
167 |
76,5 |
7 |
753 |
649 |
718 |
493 |
414 |
8 |
899 |
836 |
816 |
847 |
783 |
9 |
746 |
643 |
810 |
636 |
н.т |
10 |
211 |
367 |
317 |
240 |
н.т |
M + |
662,6 |
679 |
676,5 |
640 |
559,0 |
Рисунок 4. Концентрация ИЛ-6 (пг/мл) в культуральных супернатантах.
Из представленных данных следует, что Криомелт не оказывал статистически значимого влияния на продукцию ИЛ-6, осуществляемую митоген-активированными мононуклеарными клетками человека.
Как известно, ИФ-альфа играет ключевую роль в противовирусной защите организме. Данные, характеризующие продукцию этого цитокина митоген-активированными мононуклеарными клетками в присутствии КР, представлены в таблице 7 .
Таблица 7. Содержание ИФ-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах.
№ |
ФГА |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
КР |
1 |
14,5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2 |
0 |
0 |
0 |
28,5 |
7,5 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1,5 |
4 |
10,5 |
23 |
0 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
17,5 |
6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
7 |
0 |
0 |
0 |
0 |
40 |
8 |
11 |
21 |
0 |
8 |
0 |
9 |
0 |
4 |
14,9 |
28 |
н.т. |
10 |
0 |
0 |
22 |
0 |
н.т. |
Как следует из представленных данных, Криомелт оказывал разнонаправленное влияние на продукцию ИФ-альфа мононуклеарными клетками, полученными от разных доноров.
Пролиферативный ответ лимфоидных клеток может являться суммарным показателем эффективности иммунотропного воздействия вещества. Данные, характеризующие влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию представлены в таблице 8 и рисунке 5.
Таблица 8. Влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию.
№ |
контроль |
ФГА |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
ФГA+КР |
КР |
1 |
163 |
3007 |
4345 |
2546 |
2520 |
3733 |
2 |
214 |
3640 |
3902 |
1467 |
3776 |
2919 |
3 |
263 |
5011 |
3473 |
2850 |
3454 |
3477 |
4 |
224 |
5374 |
3626 |
4923 |
11664 |
5632 |
5 |
246 |
1803 |
3211 |
2960 |
2158 |
5365 |
M + |
222 + 33 |
3767 +1283 |
3711+380 |
2949+1097 |
4714+3454 |
4225+1054 |
Рисунок 5. Влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию
Согласно полученным данным КР сам по себе, обладает выраженной способностью стимулировать лимфоидную пролиферацию, сопоставимую с таковой ФГА. Интересно, что эффекты ФГА и Криомелт на пролиферацию не суммировались.
Выводы:
1) Криомелт не оказывает значимого влияния на относительное содержание CD4+RO- и CD4+RO+ Т-клеток в митоген-активированной популяции лимфоцитов.
2) Криомелт способен самостоятельно увеличивать относительное содержание CD8+RO- и СD8+RO+ Т-клеток в митоген-активированной популяции лимфоцитов.
3) Криомелт способен ингибировать продукцию клетками ФНО-альфа.
4) Криомелт не оказывает существенного влияния на клеточную продукцию ИЛ-6.
5) Криомелт может не являться интерфероногеном.
7) По отношению к лимфоцитам Криомелт обладает выраженными митогенными свойствами.
6) Полученные данные предполагают наличие у Криомелт выраженных иммуномодулирующих свойств, которые отличают его от других иммунотропных препаратов, обладающих противовирусной активностью.